HPLC鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题

  原标题:HPLC鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题

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  高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法,这些方法在使用的过程中往往会遇到诸如鬼峰、基线漂移、拖尾、分叉峰、保留时间漂移、柱压过高等系列问题,如何解决这些问题呢?请随小析姐一起看看吧!

  1.用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?

  ②存在干扰峰,解决办法为使用较长的柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子;

  ⑩检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线.做HPLC分析时,柱压不稳定,原因何在?如何解决?

  5.我最近更换了另一种牌号的ODS柱,虽然分离情况仍可以,但保留时间不能重现,为什么?

  这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力,尽管过去几年来,填料的制造技术有了极大的提高,但不同的厂商的ods填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此,同一被分析物中的各组分在不同牌号的ods柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物,如,三乙基胺(tea),将会使硅醇基的成键能力饱和,从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。如分离情况可以,系统稳定,达到系统适用性要求,就不必保留时间的重现。

  柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因:

  HPLC分析中,在色谱柱正常,样品灵敏度足够,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度),峰型应对称而尖锐。但是,在对样品了解程度不够,方法不妥,样品处理方法及进样方式不合理下,会出现各种意想不到的问题,而对色谱峰难以作出合理的解释,尤其对于新手更是如此。下面根据本人几年工作的体会,提出一些看法,向同仁指教。色谱双峰指的是明是一种物质,但在色谱图中出现双峰,而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。

  如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现(出峰越快,双峰的可能性会减少),尤其采用单一纯物质时,可以肯定色谱柱出问题-柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头受堵,将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂,将堵在柱头的残留物冲掉,再反过来,一般情况下就行了。当然不反冲,正冲有时也会正常的。如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头固定相变脏或流失可能性更大,这是可以将进样那头拧开,将微孔滤片超声,柱头刮去一部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这种活,需要一定技术,同时不能老干那种事,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效很低而报废。

  许多HPLC分析者对此可能不以为然,一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容,而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前,HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂,如,纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主,样品进样量大,如,定量管为20μL,此条件下完全可以肯定,单一的纯物质出双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因,另一个原因是,进样量不一定大,但绝对量很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。

  有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时,在一个特定的条件下,一种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其pH,双峰现象将消失,如,红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,用质谱检测器,其质谱的总离子流图上较明显,例如,我分析过的农药啶虫眯(吡虫清)。

  记录的参数一般都内定的,不必修改,但GC和HPLC的参数是不完全一致的,例如,c-r3a数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2MS,HPLC为5MS,如果记录间隔时间缩短,一个峰将变为二个峰或更多。

  不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形:不慎未及时补充流动相,泵将溶剂瓶中的流动相吸干了,HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱?泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了?色谱柱还能使用吗?事实上,如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干,并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气,泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体,而不能输送空气。

  相比之下,另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样,整个色谱柱干涸的情况不太容易发生,多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了,因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了,也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂(如经氦气脱气的甲醇)冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面;已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要(以1mL/min的流速)冲一个小时或更多的时间被彻底浸润,恢复到正常状态。

  如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱,使用peek材料制成的管路和接头会非常方便。peek管路容易连接;peek接头不仅无需工具,手拧即可固定,而且容易调节锥箍之外的管路长度,方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。

  使用此类材料的管路需要注意的是:peek对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解peek材料的明显迹象,但,peek遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力,但peek管只能耐受近4000psi(但多数hplc应用系统压力不会超过3000psi)。

  许多色谱工作者在操作液相色谱时,色谱柱是在室温环境下工作的。如果实验室的温度能保持不变的话,不会有什么大问题。但大多数的工作环境温度是不断变化的,因此若想将在某实验室开发的一种液相色谱方法应用到其他实验室的话,温度的差别就会引起较复杂的问题。温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的,本文就来讨论液相色谱方法中的梯度洗脱方式受温度影响的问题。

  大多数色谱工作者知道等度洗脱时温度会影响保留时间。图1显示了三个不同温度下的分离结果。我们发现当温度升高时所有的色谱峰都前移了,等度洗脱时一般温度每升高一摄氏度保留时间会缩短1-3%,在图1中,保留时间变化率约为2%/℃。

  拥有温控系统的实验室一般都有全天候温控设置,但这种设置可能引起室温显著变化,这对整夜运行的色谱系统就会有一些影响,例如,我们实验室的夜间温度就设为4~7℃。在不同的季节,实验室的夜间温度可能比正常工作日的温度高或低,这种温度的变化就会使色谱峰离开“保留时间窗”,造成连续进样中产生一系列的无效数据。

  温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的。图2是苯胺和苯酸在三个温度条件下的色谱图。图1中,20℃的温度变化引起保留因子的变化大约为两倍,然而在图2中,40℃的变化使保留改变了约20%。平均来说,图2中的色谱保留变化约为0.2%/℃。由此可见,温度变化对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响(假定本例具有普遍代表意义)。即便如此,若梯度洗脱时不控制温度的话,保留值一般都会有较大的变化。

  我们发现柱温在液相色谱梯度洗脱过程中扮演了一个重要的角色,首先,提高柱温可以缩短保留时间,其次,我们看到柱温还可以影响选择性,最后,温度的不平衡会导致峰扭曲变形。这些提醒我们,如果想得到稳定可靠的分离结果,色谱柱的温度变化是不可忽视的。

  ①柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)

  ①检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。

  保留时间不重现有两种不同的情况:既保留时间漂移和保留时间波动。前者是指保留时间仅沿单方向发生变化,而后者指保留时间无固定规律的波动。将此两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。如,保留时间的漂移往往由柱老化引起;而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上,保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化,如固定相流失(例如,通过水解),色谱柱污染(由样品或流动相所致)等。保留时间漂移的几种最常见的原因如下:

  如果我们观察到保留时间漂移,首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10~20个柱体积的流动相,但如果在流动相中加入少量添加剂(如,离子对试剂)则需要相当长的时间来平衡色谱柱。

  固定相的稳定性都是有限的,即使在推荐的pH范围内使用,固定相也会慢慢水解。例如,硅胶基质在pH=4时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定;长链键合相比短链键合相稳定;烷基键合相比氰基键合相稳定的多。

  保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器,它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是:流动相本身,流动相容器,连接管、泵、进样器和仪器密封垫,以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。

  样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分,就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质,如,配药中的赋形剂,生化样品(如,血清)中的蛋白及类脂类化合物,食品样品中的淀粉,环境水样中的腐殖酸等。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量,在此情况下,保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取(SPE)等样品前处理方法来去除样品基质的影响。

  避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下,找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂,但并非所有污染物都可以在流动相中溶解,如,thf可去除反相色谱柱中的许多污染物,但蛋白在thf中就不能溶解。dmso常常用于去除反相色谱柱中的蛋白。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。

  流动相组成的缓慢变化也是保留时间漂移的常见原因。如流动相中易挥发组分的挥发及循环使用流动相等。

  当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时,有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象,这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相,再用高水含量的流动相进行平衡。色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱(如,waters symmetryshield rp色谱柱)或非端基封口的色谱柱(如,waters resolve色谱柱)也可避免发生坍塌。

  改变流动相组成和温度;改变柱长、柱内径和填料粒度;柱突然阻塞压力升高(正常情况下其它条件不变柱压都是逐渐升高的)。

  改变流动相的组成或溶剂溶剂强度就可以改变峰容量因子和保留时间。在一定条件下,减少保留时间或缩短分析时间的溶剂为强溶剂,增加保留时间或延长分析时间的溶剂为弱溶剂。

  在分析多组分样品时,仅改变流动相的强度(组成百分比)而不改变其组成,一般仅仅改变所有组分的保留时间,不会发生峰位的重排。

  加热回流脱气,脱气效果最佳,但无法保持;氦脱气,此方法脱气效果佳,能除去百分之九十以上的空气,但氦气价格太贵,所以用的不多;真空脱气,效果仅次于氦脱气,但脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失;超声脱气,只能脱去约百分之三十的空气,但,在实验室中最常用。目前还是尽量争取用在线脱气,方便且效果好。

  评介一根色谱柱的基本指标是:塔板数、峰不对称因子、柱压降、适用范围和键合相浓度以及峰容量。

  时间常数实际上是响应时间的设定,起着过滤噪音的作用。时间常数太小(太快)可能增加短噪音,时间常数太大(太慢)可能出宽峰、拖尾峰。

  所用的流动相在检测波长下有吸收,而进在此波长下没有吸收或吸收低于流动相的溶液,在流动相中会出现洞穴,通过柱后出现倒峰。

  用比流动相强度大的大体积样品进样,通常会损害色谱图的质量,而出现“胖”峰和平头峰。应遵循下列规则选用溶剂溶解样品:

  在良好的色谱分离中,样品分子是以单一的保留过程被保留,如在反相色谱中,溶质与柱填料的非极性烷基链发生疏水性相互作用,但,在以硅胶为基质的填料中,有些样品组分能与硅醇基团相互作用,脱附的过程很慢,使峰严重拖尾,这就是次保留过程。对付次保留效应最有效的方法就是选用封尾更好色谱柱或加入流动相改良剂(也叫扫尾剂)。

  因柱温问题很易引起前延峰,有些样品在常温下分离可见前延峰,提高温度后前延峰的现象消失。在离子对色谱中,前延峰的另一个原因是用非流动相作样品溶剂。因此在离子对色谱中要求仅用流动相溶解样品,而且进样量不要太大,否则会导致前延峰或其它问题。在rp-HPLC中样品溶液的强度大于流动相引起前延峰。增加流动相的强度,减少样品溶液的强度,在离子对色谱中增加离子强度,可以克服前延峰的效应。此外使用流动相溶解样品是解决的最简单实用的方法。

  柱平衡慢的常见原因是,组分在旧的或新的流动相中对柱吸附强,或者,在新的流动相中浓度小甚至为零:

  在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高压流动相,样品以柱塞式注入色谱柱后,因柱的阻力大,样品分子在柱中的分子扩散很小,直至它从色谱柱流出也未与色谱柱内壁接触,因而引起的色谱峰形扩展很小,能保持高柱效。

  通常噪声是指由仪器的电气元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动;

  漂移是基线的一种向上或向下的缓慢移动,可在较长时间(0.5~1h)内观察到。它可掩蔽噪声和小峰。漂移与整个液相色谱系统有关,而不仅是由检测器引起的;

  在一个特定分离工作中, 检测器是否有足够的灵敏度是十分重要的。当比较检测器时,常使用敏感度这一性能指标。敏感度即指信号与噪声的比值(信噪比)等于2时,在单位时间内进入检测器的溶质的浓度或质量。

  在进行定量分析时,希望检测器有宽的线性范围,以便在一次分析中可同时对主要组分和痕量组分同时进行检测;

  它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的1/10,否则会产生严重的柱外谱带扩展。

  设定泵使用一个单独通路(a),打开purge阀,流速5mL/min,提起其他溶剂瓶内的溶剂过滤头直至离开液面,观察这些通路(b、c、d)内的溶剂是否随着流动,正常时均不应流动。

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